Flag 磁珠DYKDDDDK


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所在地: 山東 青島市
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最后更新: 2024-12-27 13:00
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公司基本資料信息
 
 
產(chǎn)品詳細說明

DYKDDDDK-Nanoab-Magnetic Beads

貨號:FNM-25-1000

儲存條件:可在4℃保存1年(確保wan全密封),避免離心,干燥和凍融。

產(chǎn)品描述:

偶聯(lián)anti-Flag-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀Flag-tag融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢:

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈,背景干凈;

即用型,節(jié)約時間;

高親和力,高載量。

應(yīng)用范圍:

可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、酶活性測定、質(zhì)譜分析等。

特異性

特異性結(jié)合位于融合蛋白N-端、C-端及內(nèi)部的Flag-tag。

產(chǎn)品特性:

存儲緩沖液:PBS(含有20%乙醇)。

保存條件:可在4℃保存1年(確保wan全密封),避免離心,干燥和凍融。

DYKDDDDK-Nanoab-Magnetic 實驗步驟:

收集細胞
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 個表達Flag-tag融合蛋白的細胞,可根據(jù)Flag-tag融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù)。

吸出培養(yǎng)基,向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS,漂洗2次,利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞,細胞轉(zhuǎn)移到離心管,500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理:

取適量植物組織(葉片等)放置于冷凍液氮中,之后將冷凍后得植物組織放于研缽進行研磨,盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液(已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等)進行裂解,為了提高裂解效率,加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,裂解完成后 12000 rpm,離心 30min,吸取上清 置新的離心管中,棄去沉淀。

細胞裂解:
1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2.置于冰上30分鐘,可每10分鐘充分吹打一次。
3.4℃,20,000g離心15分鐘,將裂解產(chǎn)物(上清)轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中,丟棄沉淀。注意:此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結(jié)合蛋白
4.將40μl平衡好的Flag-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產(chǎn)物中(可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl該產(chǎn)品),于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要,留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析。
5.在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),丟棄上清液。如果需要,留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子
6.用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸5中的Flag-Nanoab-Magnetic Beads,在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),丟棄上清液并重復(fù)清洗3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白
方法一:
7.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Flag-Nanoab-Magnetic Beads。95℃,加熱10min充分變性,在磁力架上進行分離,收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二:
8.加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,孵育時間30秒,期間不斷混勻,在磁力架上進行分離并收集上清,立即加入5μl 1.0 M Tris(pH10.4)以中和酸性的gan氨酸。

注意:為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。

方法三:

9. 加入40?M Flag-peptide進行洗脫。

可選實驗方案
方案一:
如需進行Flag融合酶的活性檢測,無需洗脫,可以直接檢測。
方案二:
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗,主要用于含有Flag融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定,染色質(zhì)斷裂不變;然后接著直接進入說明書的第4步,加入細胞裂解產(chǎn)物后,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到Flag-Nanoab-Magnetic Beads上;
進入第5和6步,分離得到復(fù)合物;進入第8步,得到洗脫的復(fù)合物;后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗步驟同上。
方案三:

Flag-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用,也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法,得到洗脫的復(fù)合物后,然后進行SDS–PAGE分析,用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,切下未知蛋白的條帶,用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。


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